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Protocol for using the ChemoTx® System

ChemoTx® 一次性趨化系統(tǒng) ChemoTx 系統(tǒng)是標(biāo)準微孔板格式的一次性趨化/細胞遷移室，96 孔或 384 孔。它與大多數(shù)熒光和密度測定酶標(biāo)儀，以及大多數(shù)液體分配機器人兼容。目前有 3 個平板可用，2 個為 96 孔板，微孔體積為 30 或 300µ，1 個為 384 孔板，微孔體積為 10µ。均由組織培養(yǎng)級透明聚苯乙烯制成。聚碳酸酯軌道蝕刻 (PCTE) 過濾器粘合到金屬框架上，并在每個測試部位周圍選擇性地涂上疏水掩模。這種面罩允許將細胞懸液直接移液到過濾器頂部的位點上，在那里它呈半球形液滴，從而消除了上層孔的需要。過濾器底部和板邊緣之間的密封也由疏水面罩提供，消除了墊圈和夾緊硬件。通過這種設(shè)計，頂部和底部液體中的氣泡截留小化：在頂部，因為沒有“孔”截留氣泡；在過濾器下方，因為孔邊緣和過濾器底面之間的密封是水密封，而不是蒸汽密封，因此氣泡可能逸出。

使用 Neuro Probe 96 孔 ChemoTx® 系統(tǒng)填充微孔板的方案 ChemoTx®96 孔微孔板含有 30µL 或 300µL 液體。使用 300µL ChemoTx® 板時，請參考括號中的體積。移液器，尤其是多通道移液器實際分配量的變化可能相當(dāng)大。為了幫助彌補這一點，ChemoTx® 微孔板設(shè)計有碟形邊緣。這種微孔邊緣設(shè)計允許每個微孔中的體積在 27µL-31µL (295µL-303µL) 之間，且結(jié)果良好。相應(yīng)地，將移液器設(shè)置為 29µL (299µL)，以便即使在遞送體積變化±2µL (±4µL) 后，您仍處于正確范圍內(nèi)。當(dāng)微孔中的體積在 27-29µL (295-299µL) 之間時，應(yīng)用后過濾器下似乎會截留氣泡。從上方觀察時，微孔將是這樣的：然而，這不是一個捕獲的氣泡。孔邊緣和過濾器底部之間的密封僅為水封，而非空氣密封。因此，當(dāng)用移液器將細胞懸液吸取到過濾器頂部時，1-2μl 培養(yǎng)基 (1-5μl) 可流經(jīng)過濾器并置換空氣

過度灌裝如果微孔過度灌裝，應(yīng)用過濾器迫使過量液體溢出邊緣并破壞水性密封件。然后，當(dāng)您將細胞懸液添加到過濾器頂部時，孔可能會泄漏。下圖表示過度填充微孔的后果：n 填充不足如果您向微孔中移取的液體太少，過濾器的底面將不會接觸液體。這可防止細胞懸液與微孔板中的液體接觸，并捕獲孔中的空氣，防止擴散和遷移。n 故障排除我們建議您的移液器初始設(shè)置為 29µL (299µL)。然而，由于每個移液器不同，您可能需要優(yōu)化移液器設(shè)置。填充一列孔并應(yīng)用過濾器。查看過濾器頂面，查看過濾器與孔中液體接觸區(qū)域周圍是否有干燥的環(huán)狀物。如果微孔中的液體與過濾器之間沒有接觸，則它們被填充不足。如果有液體溢出邊緣的井，則它們被過度填充。調(diào)整移液器設(shè)置，以補償這些問題的出現(xiàn)。如果您正在使用多通道移液器，并且您在同一列中同時存在這兩個問題，則：a）一個或多個吸頭與移液器之間存在泄漏；b）一些吸頭上的污染導(dǎo)致液體分配不均；c）您的移液器太不準確，無法與 ChemoTx® 配合使用，或 d）上述幾項。如果 a），重新固定移液器吸頭；如果 b），加載新的干凈吸頭；如果 c）或 d），嘗試使用不同的移液器。

如果在幾個微孔上偶爾發(fā)生輕微填充不足，可以通過使用干凈的圓形末端玻璃攪拌棒（或類似儀器）輕輕向下推動過濾器頂部，直至過濾器與液體接觸來克服。一旦接觸，當(dāng)在過濾器頂部移液時，細胞懸液中的液體將取代微孔頂部的空氣。質(zhì)控品除正常陰性質(zhì)控品外，我們還建議將已知使用的細胞懸液系列稀釋液移液到一行或一列孔中。在這些微孔上方的過濾部位，請勿移取細胞懸液。在這些孔中移取與過濾器頂部位置相同體積的液體為方便。如果您正在使用 30µL 微孔板上具有 5.7 mm 微孔位點的過濾器，則必須對該技術(shù)進行體積調(diào)整。讀取平板讀數(shù)時，該連續(xù)稀釋度作為標(biāo)準或度量，與實驗孔讀數(shù)進行比較。例如，如果實驗中每個位點使用 10000 個細胞，則吸取 10000 個細胞到 A1 中，5000 個細胞到 B1 中，2500 個細胞到 C1 中，…，78 個細胞到 H1 中。定位濾器并添加細胞懸液當(dāng)微孔板上加載化學(xué)引誘物和對照物時，將有框濾器置于其上方，并將濾器框架角落的孔與微孔板上的四個針頭對齊。確過濾器上的 A1 位點位于微孔板上的 A1 孔上。向下用力按壓框架的四個角，直到其緊貼在微孔板邊緣。注意框架必須與板的周緣接觸才能正常工作。（參見上述照片。）
 

有框濾波器也有兩種配置。直徑為 3.2 mm 的部位暴露面積為 8 mm2，而直徑為 5.7 mm 的部位暴露面積為 25 mm2如果您使用的是 3.2 mm 的位點，則用移液器吸取 20µL-25µL 細胞懸液至每個位點（上述推薦的任何連續(xù)稀釋孔除外）。如果您使用的是 5.7 mm 部位，則移取 50µL-60µL 細胞懸液。垂直握住移液管，緩慢均勻地擠出細胞懸液。我們推薦一種作用緩慢、平穩(wěn)的移液器；電子多通道移液器是該應(yīng)用的理想選擇。請使用這些面積和體積數(shù)據(jù)，結(jié)合下表中的孔隙密度，確定待加載的適當(dāng)細胞數(shù)量和適當(dāng)?shù)募毎麧舛取？讖娇紫睹芏?2µm 2 x 104 孔/mm2 3µm 2 x 104 孔/mm2 5µm 4 x 103 孔/mm2 8µm 1 x 103 孔/mm2 10µm 1 x 103 孔/mm2 12µm 1 x 103 孔/mm2 讀取 ChemoTx® 過濾器和微孔板孵育后，取下蓋子，過濾器仍在原位，取出細胞懸液。這可以通過使用實驗室濕巾吸干來完成。然后用小刮匙型細胞收集器或棉簽輕輕擦拭過濾器頂部的細胞。在水槽或容器上以 45° 的角度固定微孔板和連接的過濾器，并使用介質(zhì)小心沖洗過濾器的頂面。將培養(yǎng)基應(yīng)用于過濾器的頂部邊緣，并使其輕輕流過過濾器表面。目標(biāo)是從頂面去除未遷移的細胞，而不干擾已通過過濾器遷移的細胞。