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TGIRT模板互轉(zhuǎn)RNA測(cè)序擴(kuò)增試劑盒(TGIRTKit25)

說(shuō)明書(shū)

轉(zhuǎn)換原理圖

1.1.本試劑盒包含:

本試劑盒適用于Illumina RNA-seq分析中的模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)，包括預(yù)混修飾的RNA/DNA異源雙鏈寡核苷酸的TGIRT^®-III酶，DTT及反應(yīng)緩沖液。本試劑盒可用于以RNA為模板合成5'端帶RNA-seq接頭的cDNA。在用于RNA-seq文庫(kù)的構(gòu)建時(shí)，必須在PCR擴(kuò)增前用熱穩(wěn)定的5'AppDNA/RNA連接酶 (New England BioLabs; M0319S or M0319L)在cDNA的3'端引入另一個(gè)RNA接頭（可單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)）

1.2.TGIRT®-III酶的特性：

該酶比逆轉(zhuǎn)錄酶具有更好的熱穩(wěn)定性、持續(xù)合成能力和保真性，可以實(shí)現(xiàn)從復(fù)雜結(jié)構(gòu)或高度修飾的RNA進(jìn)行全長(zhǎng)、末端到末端的cDNA合成^{1，4,5,6,7,8}。

*的末端到末端模板轉(zhuǎn)換活性可以實(shí)現(xiàn)在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中添加RNA-seq或PCR接頭，并且無(wú)需單獨(dú)在RNA 3'連接接頭。模板轉(zhuǎn)換活性大大便利了鏈特異RNA-seq文庫(kù)的構(gòu)建，比用隨機(jī)單鏈六聚體引物或使用RNA 連接酶進(jìn)行接頭連接的方法有更好的保真性^{1,4,7, 8}。

1.3.TGIRT®-III酶適用于：

1.各種鏈特異轉(zhuǎn)錄組分析。

2.全細(xì)胞、外泌體、血漿/細(xì)胞質(zhì)及其它無(wú)細(xì)胞RNA樣品的RNA-seq。

3.miRNA和其它小分子非編碼RNA的分析。

4.RIP-seq, HITS-CLIP, CRAC, 核糖體分析。

1.4.TGIRTKit25的優(yōu)勢(shì)：

1.更強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄分析能力及無(wú)偏差分析。

研究表明，去核糖體RNA、片段化通用人類標(biāo)準(zhǔn)RNA參照樣本的TGIRT®-seq測(cè)序兼具人類轉(zhuǎn)錄本相對(duì)豐度和人工合成mRNA的眾多優(yōu)點(diǎn)，與非鏈特異性TruSeq v2測(cè)序相當(dāng)，比鏈特異性Tru-Seq v3更具優(yōu)勢(shì)。TGIRT®-seq在鏈特異性上明顯優(yōu)于Tru-Seq v3，但卻沒(méi)有TruSeq v3測(cè)序固有的源于隨機(jī)引物的樣本偏差。同時(shí)，TGIRT®-seq表現(xiàn)出更均一的5’端到3’端基因覆蓋以及鑒定更多的剪切位點(diǎn)，還可同時(shí)在同一次RNA測(cè)序中分析mRNAs、lncRNAs和小分子非編碼RNA，包括在TruSeq中通常無(wú)法分析的tRNA⁸。

2.可對(duì)全細(xì)胞、外泌體、血漿/細(xì)胞漿等其它胞外RNA進(jìn)行測(cè)序分析。

快速（全程小于5小時(shí)，包括RNA文庫(kù)構(gòu)建及PCR步驟），樣本需要量極少（納克級(jí)），強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄組分析能力，包括 mRNAs、lncRNAs以及其它小分子非編碼ncRNAs，如全長(zhǎng)tRNAs和 pre-miRNAs等，較常規(guī)RNA測(cè)序分析具有更小的偏差^7,8。

3.比常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄RT有更強(qiáng)大的持續(xù)合成能力和鏈置換能力。

強(qiáng)大的持續(xù)合成能力和鏈置換能力可實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)的、末端到末端的tRNAs及其它小分子非編碼RNA的cDNAs，這是常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄RT無(wú)法實(shí)現(xiàn)的^4-7。

4.利用TGIRT®模板轉(zhuǎn)換法構(gòu)建RNA測(cè)序文庫(kù)可用于miRNA，RIP-seq, HITS-CLIP, CRAC, 核糖體測(cè)序分析。

快速便捷（全程小于5小時(shí)，包括RNA文庫(kù)構(gòu)建及PCR步驟），僅需少量樣本（納克級(jí)），無(wú)需RNA連接酶，無(wú)偏差。

1.5.參考文獻(xiàn):

1.Mohr, S., Ghanem, E., Smith, W., Sheeter, D., Qin, Y., King, O., Polioudakis, D., Iyer, V.R., Hunicke-Smith, S. Swamy, S., Kuersten, S., and Lambowitz, A.M. Thermostable group II intron reverse transcriptase fusion proteins and their use in cDNA synthesis and next-generation RNA sequencing. RNA 19, 958-970, 2013.

2.Collins, K. and Nilsen, T. Enzyme engineering through evolution: thermostable recombinant group II intron reverse transcriptases provide new tools for RNA research and biotechnology. RNA 19, 1017-1018, 2013.

3.Enyeart, P.J., Mohr, G., Ellington, A.D., and Lambowitz A.M. Biotechnological applications of group II introns and their reverse transcriptases: gene targeting, RNA-seq, and non-coding RNA analysis. DNA 5:2, 2014.

4.Katibah, G.E., Qin, Y., Sidote, D.J., Yao, J., Lambowitz, A.M. and Collins, K. Broad and adaptable RNA structure recognition by the human interferon-induced tetratricopeptide repeat protein IFIT5. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 111, 12025-12030, 2014.  

5.Shen, P.S., Park, J., Qin, Y., Li, X., Parsawar, K., Larson, M.H., Cox, J., Chen, Y., Lambowitz, A.M., Weissman, J.S., Brandman, O., and Frost, A. Rqc2p and 60S ribosomal subunits mediate mRNA-independent elongation of nascent chains. Science 347, 75-78, 2015.

6.Zheng, G., Qin, Q., Clark, W.C., Yi, C., He, C., and Lambowitz, A.M. and Pan, T. Efficient and quantitative high-throughput transfer RNA sequencing. Nature Methods, 12, 835-837, 2015.

7.Qin,Y., Yao,J., Wu,D., Nottingham, R., Mohr, S, Hunicke-Smith, S., Lambowitz, A.M., High-throughput sequencing of human plasma RNA by using thermostable group II intron reverse transcriptases. RNA 22, 111-128, 2016.

8.Nottingham, R.M., Wu, D.C., Qin, Y., Yao, J., Hunicke-Smith, S., and Lambowitz, A.M. RNA-seq of human reference RNA samples using a thermostable group II intron reverse transcriptase. RNA, 22, 597-613, 2016.

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